Métodos para quantificar o crescimento microbiano

Métodos diretos

     Existem diferentes métodos para quantificar o crescimento microbiano; Alguns determinam o número de células e outros analisam a massa total da população, que e diretamente proporcional ao numero de células. A quantificação de uma população geralmente é realizada considerando o numero de células em 1 mL do meio liquido ou 1g do material solido. Mas como populações bacterianas são muito grandes, são usadas pequenas amostras dessas para contagem por métodos diretos ou indireto. Depois, o resultado é colocado em formulas matemáticas para calcular o valor final. 
 

1) Contagem em placa

      É a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana.

 Vantagem: as células viáveis (vivas) são quantificadas.

 Desvantagem: tempo de incubação longo, em geral 24h, para o aparecimento das colonias visíveis em placa. 

      Esse tempo pode impedir o uso dessa técnica em áreas como controle da qualidade do leite pois não é possível manter o lote por um período longo. Esse método considera que cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma bactéria. Isso nem sempre é verdade, uma vez que as bactérias frequentemente crescem em cadeias ou em grumos. Para refletir essa realidade, as contagens em placas são feias nas chamadas unidades formadoras de colônias (UFC).

      Para realizar esse método, é essencial que somente um numero limitado de colonias cresça em cada placa. Quando muitas colonias estão presentes, ocorre saturação impedindo o crescimento de algumas colonias e dificultando a contagem. Pela convenção do Food and Drug Administration, órgão norte0americano que controla alimentos e medicamentos, deve-se realizar a contagem em placas que contenham de 25 a 250 colonias, mas microbiologistas preferem de 30 a 300 colonias.

      Quando essa metodologia é empregada, deve-se utilizar o método da diluição seriada para garantir que o numero de colonias na placa permaneça na faixa desejada.

 Diluição seriada: Exemplo: amostra de leite com 10 mil bactérias / mL. A inoculação de 1 mL dessa amostra em uma placa com meio de cultivo resultará no crescimento de 10 mil colônias e será impossível fazer a contagem. Mas se 1 mL de leite for transferidos para um turbo contendo 9 mL de água estéril (diluição), cada mL da amostra deste tubo conterá 1000 bactérias. Esse numero ainda é grande para fazer a contagem. Portanto, uma nova diluição seriada deverá ser realizada, transferindo 1 mL (com 1000 bactérias) para um novo tubo com 9mL de água estéril).; nesse ultimo tubo, cada mL conterá 100 bactérias, que quando inoculado deverá originar 100 colônias, que podem ser facilmente contadas.

Existem dois métodos para se realizar a contagem de bactérias em placa: método de espalhamento em placa e método pour plate.

Método pour plate: No método pour plate o inoculo pode ser realizado com um volume te 1 ml ou 0,1 mL da diluição bacteriana diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em banho-maria a 50 ºC para impedir a solidificação do ágar, é vertido sobre a amostra, que será misturada por agitação suave da placa. Após solidificação do ágar, a placa é incubada na temperatura de crescimento da bactéria. Nesse método o crescimento das colônias das bactérias ocorre dentro do meio de cultivo e na superfície do meio de cultivo. 

Desvantagem: Microrganismos sensíveis ao calor podem ser danificador pelo agar fundido (liquido a 50 ºC) e podem ficar impossibilitador de formar colonias, quando algumas meio de cultivo diferenciais são usados, a aparência característica de uma colonia na superfície do meio é essencial para que haja o diagnostico e as colonias formadas abaixo da superfície não são apropriadas para estes testes.

Método de espalhamento em placa: método mais usado. O inóculo de 0,1 mL é adicionado a superfície do meio contendo agar ja solidificado. O inoculo é, então, espalhado uniformemente na superfície com a alça de Drigalski. Esse método não tem as desvantagens do me´todo pour plate porque as colonias crescem somente na superfície do meio e não entram em contato com o agar fundido (liquido a 50 ºC).

2) Filtração 
 
      Aplicado para contar amostras em que o numero de bactérias é muito pequeno, como lagos e fontes de água. Esse método permite que a bactérias seja concentrada sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos (bactéria não passa pelos poros) após passagem de um volume de 100 mL de água. Essa membrana é transferida para uma placa de Petri com um suporte embebido em nutriente líquido, que permite que as bactérias se desenvolvam sobre a membrana. Esse método é usado para detecção e registro de coliformes (indicadores de poluição fecal) em amostras de alimentos e águas. Coliformes podem ser identificador por meios de cultivo diferenciais.

3) Método do Número Mais Provável (MNP)

     É uma técnica estatística com base no seguinte princípio: quanto maior o numero de bactérias em um a amostra, maior será o numero de diluições necessárias para eliminar totalmente o crescimento em tubos com meio de cultura.
      Esse método é o mais usado quando as bactérias a serem contadas não cresceriam em meio sólido (como bactérias quimioautotróficas nitrificantes), ou quando o crescimento de bactérias em um meio liquido diferencial é usado para identificar os microrganismos (como coliformes em água, que seletivamente fermentam lactose produzindo ácido). O método fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana conter um numero de bactérias e que o NMP da tabela é estatisticamente o numero mais provável. 

4) Contagem Direta ao Microscópio

    Nesse método um volume conhecido de solução bacteriana é colocado em uma área definida de uma lamina especial de microscópio denominada célula de contagem Petroff-Hausser.
Desvantagem: Dificuldade para contar bactérias móveis, células mortas acabam sendo contadas como as vivas, necessário um grande numero de células de bactérias (cerca de 10 milhões de bactérias por mL) Para ter uma contagem satisfatória.
Vantagem: para quantificar as bactérias por esse método não ha necessidade de períodos de incubação, portanto, ela pode ser usada quando se necessita de resultados imediatos.